In Pilsen am 3. Dezember 1890 geboren, besuchte er dort zunächst eine Handelsschule, ehe er 1910 das Studium an der Akademie der Bildenden Künste in Prag begann. Nach dem Abschluss wurde er in die österreichische Armee eingezogen und geriet im Ersten Weltkrieg in russische Gefangenschaft. Dort konnte er sich der tschechischen Nationallegion anschließen, mit der er nach Kriegsende bis ans Japanische Meer gelangte. Von dort begab er sich aus bisher nicht bekannten Gründen mit einem russischen Studienstipendium nach Japan.
Nach seiner Rückkehr nach Wladiwostok übernahm er ein Schiff und führte Teile der Legion über Triest zurück. In der Tschechoslowakischen Republik wurde er als Offizier in die Armee übernommen und als Kunstoffizier teilweise freigestellt, sodass er seine künstlerischen Einflüsse aus Japan ausarbeiten konnte. In der äußerst produktiven Phase vor 1938 entstanden viele von Ostasien geprägte Arbeiten mit soldatischen Themen. Kurz vor der Besetzung durch die deutsche Wehrmacht schied er als Oberst krankheitsbedingt aus der Armee aus. Er schloss sich sogleich dem Widerstand gegen die deutschen Besatzer an.
Im März 1943 geriet er in die Fänge der Gestapo. Im Gefängnis in Kladno und in der Kleinen Festung Theresienstadt wurde er grausam gefoltert und schließlich in das KZ Flossenbürg verschleppt. Ein SS-Mann entdeckte seine Malkunst und ließ ihn in den „Karnickelstall“ als Hasenpfleger versetzen. Man versorgte ihn dort sporadisch mit Malutensilien für die Aufträge des SS-Mannes. Jedoch konnte Ota Matoušek etliches davon für sich beiseiteschaffen. So konnte er in günstigen Augenblicken im Hasenstall eigene Skizzen vom Lager und von den Tätern anfertigen.
Bei Kriegsende nahm er eine kleine Anzahl von Skizzen, die er über den mörderischen Alltag im Konzentrationslager und die Täter heimlich angefertigt hatte, mit auf den Todesmarsch. Es gelang ihm, einen Teil davon bis zu seiner Befreiung bei Stamsried zu behalten und so für die Nachwelt zu retten. Die Leere der dortigen Straße nach der Befreiung der Gefangenen blieb als bekanntes Motiv mit dem hoffnungsvollen Blick in die Zukunft erhalten.
Die erhaltenen Skizzen arbeitete er für seine umfangreiche Mappe von Lithografien mit dem Titel „Koncentrák (Konzentrationslager)“ um. Eine noch im Lager selbst 1944 entstandene Bleistiftzeichnung blieb auf diese Weise ebenfalls erhalten und ist heute Bestandteil der Sammlung ERINNERUNG der Arbeitsgemeinschaft ehemaliges KZ Flossenbürg.
Nach dem Krieg löste sich Ota Matoušek immer mehr von den Themen der grausamen Gefangenschaft im KZ und schuf ein beeindruckendes Werk mit Bildern seiner südböhmischen Heimat und ihrer Menschen. Er wurde vielfach ausgezeichnet, und für ihn wurden große Ausstellungen im In- und Ausland veranstaltet.
Ota Matoušek starb am 3. März 1977 in seiner südböhmischen Wahlheimat České Budějovice.
